这种方法检测细胞代谢，可以兼顾灵敏度和通量！

　　新陈代谢是生物体内进行的化学变化的总称，是生物最基本的生命活动过程。ATP即三磷酸腺苷，是生物体进行各种生命活动所需能量的直接来源，被称为细胞中的能量货币。细胞的能量主要来自糖代谢，葡萄糖在体内氧化分解的途径包括糖酵解和氧化磷酸化。线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所，为细胞新陈代谢提供能量。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，有细胞"动力工厂"（powerplant）之称。细胞代谢异常会造成包括衰老和疾病（例如神经退行性疾病、糖尿病、癌症、心血管疾病、肥胖等）在内的多种疾病。

　　MitoXpress家族由一系列专用的氧原子敏感荧光探针组成，可用于评估生物的耗氧量。这些探针适用于高通量的微孔板检测系统，可在支持具有荧光功能的微孔读板机上进行相应的检测，从而克服了传统的光谱测量技术通量低的限制。

　　已知大多数的真核生物的氧消耗过程是通过线粒体中的电子传递链发挥作用，这种分析方法特别适用于线粒体功能的评估。获得的检测结果能够方便您快速且准确地评估细胞内线粒体或分离的线粒体是否存在功能障碍，作为一种简单且灵敏的线粒体功能评价手段，用于评估不同处理手段对线粒体功能的影响。测定细胞代谢中细胞耗氧量等参数指标的变化，可以帮助科研工作者解析线粒体活性和功能，更好的了解细胞代谢的真实变化，对于疾病治疗以及药物筛选具有重要意义。

　　这里我们利用MitoXpress探针和Molecular Devices多功能微孔读板机SpectraMax M5e，来评价生物耗氧量变化。检测生物耗氧量的方法所使用的荧光探针采用了时间分辨荧光（Time Resolved Fluorescence，TRF）技术。

　　MitoXpress探针检测原理

　　探针检测原理基于氧气（O2）对荧光基团的碰撞淬灭，荧光信号与孔中O2的浓度成反比。随着氧气的消耗，荧光信号逐渐增强，利用动力学测量，用户可以通过监测信号增加的速度来推断细胞耗氧量，评估线粒体的活性。利用时间分辨荧光技术进行检测，采用水溶性探针，加入、混合、检测，全流程简单快速（图1）。

图1 MitoXpress探针检测原理。(i)优化激发光谱扫描；(ii)优化发射光谱扫描显示耗氧量变化引起荧光强度成倍增加。

　　时间分辨荧光

　　（Time Resolved Fluorescence，TRF）

　　技术

　　时间分辨荧光（Time Resolved Fluorescence，TRF）技术的检测灵敏度高达10^(-12)g/ml。普通荧光的半衰期为纳秒级，而稀土元素中的镧系元素半衰期为毫秒级，这种方法正是利用了这大约6个数量级的差距，将检测窗口延迟——此时，背景信号几乎为零，而待测样品信号仍然有较高的荧光强度（图2）。

　　图2时间分辨荧光技术检测原理示意图。

　　实验优化和数据输出

　　实验优化

　　样品放置于标准96或384孔板中

　　将细胞、荧光探针和化合物加入微孔板中

　　加入矿物油避免环境中氧气的影响

　　使用Molecular Devices公司的SpectraMax M5e进行动态学检测

　　随着时间变化生成曲线反应化合物处理的效果

　　数据输出

　　在没有氧气消耗（对照）的情况下，孔内氧气浓度保持不变，所以探针信号保持稳定。生物耗氧量变化随着时间的推移，探针信号强度的增加得以评估。当氧气耗尽时信号饱和或当氧气消耗和反向扩散之间（一种可逆反应）建立平衡时达到一种稳定状态（图3）。

　　图3使用Molecular Devices公司的SpectraMax M5e进行动态学检测。

　　结果

　　线粒体功能障碍（分离线粒体）

　　MitoXpress探针可以基于高通量微孔板方式来评价线粒体耗氧量变化，使用SpectraMax M5e可以检测分离的线粒体耗氧量变化。与传统检测手段相比，利用该平台，我们能够以更高的通量获取分离的线粒体中Ⅱ和Ⅲ呼吸状态的氧摄取速率（图4）。

　　图4使用Molecular Devices公司的SpectraMax M5e进行动态学检测，评估线粒体功能障碍(分离线粒体)。

　　线粒体功能障碍（全细胞）

　　此外，这种方法也可用于进行线粒体毒性评价，即测定可能由化合物导致的线粒体功能上调（解偶联）或线粒体功能受到抑制（图5）。使用Molecular Devices公司的SpectraMax M5e进行动态学检测，评估线粒体功能障碍（全细胞）。HepG2细胞数量增加与氧气摄取速率之间呈现线性关系，即使低于50,000个细胞/ml的浓度依然具有很高灵敏度和线性关系。

　　应用特定类型的细胞系筛选评价不同效应对细胞耗氧量的影响，我们必须要求对其进行优化，使其能够达到最佳细胞数来测量氧摄取速率（图5a）。线粒体膜电位失衡后，使用K+离子通道载体缬氨霉素（1μM）处理后，HepG2细胞中解偶联氧化磷酸化的效果显示出耗氧量的明显上调。相反，未经处理的对照组，使用复合物Ⅰ特异性的鱼藤酮（1μM）和抗霉素A（1μM）对电子链的特定部分的不可逆抑制会导致细胞氧摄取率降低（图5b）。实验结果证明该平台适用于筛选新的化合物，评价其针对特定细胞系中线粒体功能的调节作用。

图5使用Molecular Devices公司的SpectraMax M5e进行动态学检测，评估线粒体功能障碍(全细胞）。（a）HepG2细胞数量增加与氧气摄取速率之间呈现线性关系，对相关实验进行优化，使其能够达到最佳细胞数来测量氧摄取速率；（b）线粒体膜电位失衡后，使用缬氨霉素(1μM)，鱼藤酮（1μM）和抗霉素A（1μM）处理后细胞氧摄取率的变化情况。

　　加氧酶活性

　　低至100个细菌也能够检测其耗氧量，细菌耗氧量伴随着其浓度的增加而变化，因此适用于细菌污染程度检测。在30摄氏度条件下，利用SpectraMax M5e多功能微孔读板机荧光强度检测功能检测大肠杆菌，激发波长设置为380 nm，发射波长为650 nm（图6），LB培养基中大肠杆菌浓度范围为101-108细胞/ml（图6a）。基于时间方式校正大肠杆菌达到预设的100 RFU值，细菌的校正曲线可使得细菌数目计算的时间从48-72小时缩减至12小时以内（图6b）。

　图6利用SpectraMax M5e多功能微孔读板机检测大肠杆菌。使用安捷伦公司的Luxcel MitoXpress Xtra荧光探针试剂盒进行检测（0.1μM的Luxcel Probe G20N-1.)。(a)LB培养基中大肠杆菌浓度范围为101-108细胞/ml；(b)基于时间方式校正大肠杆菌达到预设的RFU值。

　　一些化合物（包括常见农药）对胆碱酯酶有抑制作用，我们可以使用MitoXpress探针测量酶耗氧速率，通过测量胆碱氧化酶耗氧速率的降低来检测其抑制作用，进行如神经毒性化合物的筛选。检测在室温条件下进行，利用SpectraMax M5e多功能微孔读板机荧光强度测定功能，激发波长设置为380 nm，发射波长为650 nm（图7）。

　图7利用SpectraMax M5e多功能微孔读板机检测胆碱氧化酶耗氧速率。使用Luxcel MitoXpress Xtra荧光探针试剂盒进行检测（0.1 uM的Luxcel Probe A65N-1)。（a)通过增加有机磷农药浓度分析胆碱氧化酶的氧消耗率；（b)1000秒内氧摄取速率斜率的测定。

　　概要

　　仪器测量设置参数

　　应用领域

　　MitoXpress耗氧量检测技术可以应用于各种研究领域。线粒体功能障碍的评估属于疾病模型和药物安全的关键研究领域。这种技术可以在早期阶段通过筛选新化合物对细胞耗氧量的影响来评价线粒体毒性。在基础研究领域，该平台可应用于阐明生化途径、研究代谢途径以及评估细胞凋亡等。

　　此外，这种检测方法可以应用于分离的线粒体或细胞系。也可用于环境有毒物质的筛选，例如评估包括杀虫剂和PAH等处理对如斑马鱼胚胎、秀丽隐杆线虫、卤虫（盐渍虾）等生物耗氧量的影响。利用这种方法也可以检测原核生物的耗氧量，因此适用于食品和无菌环境的检测。

　　总结

　　生物耗氧量是一种重要的生物标志物，有关生物耗氧量变化的检测已被广泛应用于许多基础应用研究领域，包括线粒体功能研究，药物筛选、毒性评价和环境监测等。

　　MitoXpress家族荧光探针具有简单、灵活、自动化和灵敏度高等优势，广泛应用于生物耗氧量的变化，我们Molecular Devices公司的多款微孔读板机均能支持该类型检测。综上所述，结果显示我们利用MitoXpress和SpectraMax M5e多功能微孔读板机（Molecular Devices）进行生物耗氧量的检测，工作流程简单方便。可用于检测分离线粒体，完整线粒体，细菌等细胞系或完整组织的细胞耗氧量。

　　使用MitoXpress平台以及利用SpectraMax M5e友好的用户操作界面组成稳定强大的分析工具，可以简化生物摄氧率的的动力学分析，以确定氧气摄取率、增殖时间（原核生物），IC50值和绝对氧浓度。

更多详情请关注Molecular Devices美谷分子仪器官网

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